| Introducción |
Los enlaces carbono-hidrógeno (C-H), aunque frecuentes en las moléculas orgánicas, no suelen ser reactivos y suponen un reto para su manipulación química. Los recientes avances en la tecnología de funcionalización del C-H están transformando esta perspectiva, poniendo de relieve la necesidad crítica de instalar selectivamente grupos carbono-alquilo sp3 en estructuras de hidrocarburos. Este estudio presenta los primeros catalizadores basados en hierro capaces de realizar la alquilación intermolecular enantio-, regio- y quimioselectiva de enlaces C-H sp3 mediante la inserción de C-H carbénicos.
Estos catalizadores, derivados de una enzima del citocromo P450 (en concreto, una variante del "citocromo P411" con una sustitución del ligando axial de cisteína por serina), están totalmente codificados genéticamente y se producen en bacterias. Gracias a la evolución dirigida, su actividad y selectividad pueden modularse con precisión. La utilización del hierro, el metal de transición más abundante, en esta exigente química presenta una valiosa alternativa a los catalizadores de metales nobles, que tradicionalmente han dominado el campo de la funcionalización C-H. Las enzimas, perfeccionadas en el laboratorio, funcionalizan eficazmente una serie de sustratos que contienen enlaces C-H benzílicos, alílicos o α-amino, mostrando una alta rotación y una selectividad excepcional. Además, estas enzimas altamente eficientes facilitan la creación de vías sintéticas simplificadas para la obtención de diversos productos naturales. La demostración de que estas enzimas median en la alquilación sp3 C-H utilizando su cofactor intrínseco hierro-hem amplía la utilidad de la diversidad de proteínas hemo naturales para esta transformación abiológica, fomentando el avance de nuevas reacciones enzimáticas de funcionalización C-H en química y biología sintética.
Los sistemas biológicos emplean un conjunto restringido de estrategias químicas para la formación de enlaces carbono-carbono (C-C) en la construcción de moléculas orgánicas. Mientras que muchos métodos se basan en la manipulación de grupos funcionales, ciertas enzimas, como los miembros radicales de la familia de la S-adenosilmetionina (SAM), pueden realizar la alquilación de enlaces C-H sp3. Este enfoque ha demostrado ser muy versátil para la diversificación estructural, desempeñando un papel crucial en la biosíntesis de diversos productos naturales y cofactores. Sin embargo, los mecanismos biológicos existentes para esta transformación se limitan a enzimas que transfieren un grupo metilo o conjugan un sustrato aceptor radical activado a moléculas específicas, siendo la metilación un modo común para la instalación de alquilo sp3 C por enzimas radicales SAM.
Esta investigación pretendía establecer una nueva estrategia enzimática para la alquilación de enlaces C-H sp3, inspirándose en el extendido proceso biológico de funcionalización C-H de la oxigenación C-H. Las enzimas del citocromo P450 logran la oxigenación C-H utilizando un cofactor hemo, activando el oxígeno molecular para generar un intermediario hierro-oxo de alta energía capaz de insertarse selectivamente en un enlace C-H del sustrato. De forma análoga, se planteó la hipótesis de que la combinación de una proteína hemo y un compuesto diazo generaría una especie de hierro-carbeno confinado en la proteína, que podría participar en una reacción selectiva de inserción C-H con un segundo sustrato. Aunque se ha demostrado que las proteínas hemo llevan a cabo procesos de transferencia de carbenos, como la ciclopropanación y la inserción de enlaces heteroátomo-hidrógeno, su funcionalización de enlaces C-H sp3 sigue siendo un reto. La inserción sp3 C-H metal-carbeno de moléculas pequeñas, en particular las variantes intermoleculares y estereoselectivas, suele basarse en complejos de metales de transición de rodio, iridio y otros. Se han diseñado metaloproteínas artificiales para la inserción de carbenos C-H mediante la incorporación de iridio-porfirina en variantes de proteína apo hemo. Aunque poco frecuentes, existen algunos casos de inserción de C-H sp3 hierro-carbeno; estas reacciones catalizadas por hierro suelen requerir temperaturas elevadas, son estequiométricas o se limitan a procesos intramoleculares, lo que indica una elevada barrera de energía de activación para la inserción de C-H con un hierro-carbeno. Sin embargo, dado que el andamiaje proteico de una enzima puede mejorar significativamente las velocidades de reacción e incluso conferir actividad a un cofactor que de otro modo no sería reactivo, se previó que la evolución dirigida podría reconfigurar una proteína hemo para superar la barrera de la reacción de inserción C-H hierro-carbeno y adquirir esta nueva función.
Las investigaciones iniciales consistieron en el cribado de un panel de setenta y ocho proteínas hemo, incluidas variantes de citocromos P450, citocromos c y homólogos de globina. Estas proteínas hemo, dentro de células enteras de Escherichia coli (E. coli), se hicieron reaccionar con p-metoxibencilmetiléter (1a) y diazoacetato de etilo (2) a temperatura ambiente en condiciones anaeróbicas. Posteriormente se analizaron las reacciones para la formación del producto de alquilación C-H 3a. Las hemoproteínas de dos superfamilias mostraron niveles bajos de esta actividad promiscua, lo que demuestra la viabilidad de crear enzimas de alquilación C-H con diversas arquitecturas proteicas. Una variante modificada del citocromo P450BM3 de Bacillus megaterium, con una mutación axial de cisteína a serina (citocromo "P411"), P-4 A82L, produjo 3a con 13 cambios totales (TTN). Además, la óxido nítrico dioxigenasa de Rhodothermus marinus con la mutación Y32G (Rma NOD Y32G) catalizó la reacción con 7 TTN. Un segundo sustrato alcano, el 4-etilanisol (1i), también fue procesado por estas enzimas de alquilación C-H nacientes, aunque con números de recambio más bajos. El cofactor hemo solo (protoporfirina IX de hierro) o en presencia de albúmina de suero bovino no mostró actividad.
Utilizando P411 P-4 A82L como plantilla inicial, se llevaron a cabo rondas sucesivas de mutagénesis por saturación de sitio y cribado en células E. coli enteras para identificar biocatalizadores con actividad y enantioselectividad mejoradas para la alquilación C-H. Los residuos de aminoácidos seleccionados para la mutagénesis por saturación de sitio fueron los siguientes Entre los residuos de aminoácidos objeto de mutagénesis se encontraban los que recubren el bolsillo del sitio activo, los que residen en bucles y otras regiones flexibles de la proteína, o los que poseen una cadena lateral nucleófila. A continuación, se evaluaron las variantes mejoradas en reacciones con lisado de E. coli clarificado con p-metoxibencilmetiléter (1a) y 4-etilanisol (1i). Cinco rondas de mutagénesis y cribado condujeron a la variante P411-gen6, que proporcionó el producto 3a con 60 TTN. A diferencia de la actividad monooxigenasa nativa, el proceso de alquilación C-H no requiere equivalentes reductores de los dominios FAD y FMN de la enzima. Suponiendo que estos dominios pudieran ser prescindibles para la alquilación C-H, se realizaron truncamientos sistemáticos de P411-gen6 para determinar el dominio o dominios mínimos necesarios para la actividad catalítica. Curiosamente, la eliminación del dominio FAD, que representa el 37% de los aminoácidos de la proteína completa, dio como resultado una enzima con mayor actividad de alquilación C-H: P411ΔFAD-gen6 produjo 3a con 100 TTN, lo que representa un aumento de 1,7 veces en comparación con P411-gen6. Esto sugiere que el dominio FAD podría ejercer efectos alostéricos negativos sobre la actividad de alquilación C-H. Otras investigaciones con estas enzimas truncadas confirmaron su utilidad en células enteras de E. coli, en lisado celular clarificado de E. coli y como proteínas purificadas.
Ocho rondas adicionales de mutagénesis y cribado dieron como resultado la P411-CHF (enzima de funcionalización C-H P411ΔFAD). P411-CHF presenta una actividad 140 veces superior a P-4 A82L, produciendo 3a con una estereoselectividad excelente (2020 TTN, 96,7:3,3 e.r. utilizando lisado de E. coli clarificado). Estudios posteriores indicaron que la estereoselectividad podía mejorarse aún más llevando a cabo la reacción a temperaturas más bajas (por ejemplo, 4 °C) sin cambios significativos en el TTN. La alquilación C-H enzimática puede realizarse a escala milimolar: con 1,0 mmol de sustrato 1a, E. coli que contenía P411-CHF a 4 °C proporcionó 3a en un 82% de rendimiento aislado, 1060 TTN y 98,0:2,0 r.e.
Se llevaron a cabo investigaciones mecanísticas preliminares para comprender la naturaleza del paso de inserción del C-H. Las tasas iniciales independientes de las reacciones con el sustrato 1a o el sustrato deuterado 1a-d2 revelaron un efecto cinético isotópico (KIE) normal de 5,1 para la alquilación de C-H catalizada por P411-CHF, lo que indica que la inserción de C-H determina la tasa. Utilizando E. coli con P411-CHF, se evaluaron diversos sustratos bencílicos para su acoplamiento con diazoacetato de etilo. Tanto las funcionalidades ricas en electrones como las deficitarias en electrones del anillo aromático se toleraron bien, y los sustratos cíclicos también sirvieron como socios de acoplamiento adecuados. Los alquilbencenos se funcionalizaron con éxito en enlaces C-H sp3 bencílicos secundarios. En particular, en la biotransformación del sustrato 1l, que posee enlaces C-H bencílicos tanto terciarios como secundarios, P411-CHF funcionalizó preferentemente la posición secundaria a pesar de su mayor energía de disociación del enlace C-H (BDE). El intermedio carbeno generado a partir del diazoacetato de etilo pertenece a la clase de sólo aceptor. A diferencia de los carbenos donante/aceptor más utilizados, los intermedios de sólo aceptor son más electrofílicos, lo que hace que las reacciones selectivas con esta clase de carbeno sean un reto importante para los catalizadores de moléculas pequeñas. Nuestros hallazgos ilustran que el P411-CHF puede manejar este intermediario altamente reactivo para proporcionar los productos de alquilación sp3 C-H deseados con alta enantioselectividad.
Las enzimas pueden alcanzar una selectividad de reacción excepcional debido a su capacidad para formar múltiples interacciones con sustratos e intermedios a lo largo de un ciclo de reacción. Se planteó la hipótesis de que el andamiaje proteico podría modificarse para generar enzimas complementarias que accedieran a diferentes resultados de reacción para un sustrato dado. Cuando la P411-CHF se enfrentó al 4-alilanisol (1m), un sustrato capaz tanto de alquilación C-H como de ciclopropanación, se observó que el producto de alquilación C-H 3m dominaba, con una selectividad superior a 25:1. Por el contrario, una variante relacionada de P411 de longitud completa, P-I263F, que contiene trece mutaciones en el dominio hemo en relación con P411-CHF, catalizó exclusivamente la formación del producto ciclopropano 3m''. Además, a pesar de la conocida reactividad de los silanos con el hierro-carbeno, P411-CHF generó el producto de alquilación C-H 3h cuando se empleó el sustrato 1h en la reacción (aunque también se observó el producto de inserción Si-CH 3h'', su formación puede no haber sido catalizada por P411-CHF). Por el contrario, la reacción con P-I263F sólo produjo el producto de inserción Si-CH. Estos ejemplos ponen de relieve una característica notable de las enzimas macromoleculares: pueden obtenerse productos diferentes simplemente alterando la secuencia de aminoácidos del catalizador proteico.
La alquilación enzimática de C-H va más allá de la funcionalización de enlaces C-H bencílicos. Las moléculas estructuralmente distintas que contienen enlaces C-H alílicos o propargílicos son sustratos excelentes para esta química. A diferencia de los compuestos 1a-1m, que presentan un anillo bencénico rígido, los compuestos 4a-4c y 4e poseen cadenas alquílicas lineales flexibles. Su alquilación enantioselectiva exitosa sugiere que el sitio activo de la enzima puede acomodar la flexibilidad conformacional del sustrato mientras mantiene una orientación preferida del sustrato en relación con el intermedio carbeno. Para ilustrar la utilidad de esta biotransformación, la metodología se aplicó a la síntesis formal del ácido linbgénico. Las cianobacterias marinas incorporan esta biomolécula versátil a la familia de productos naturales malyngamide, y los enfoques de síntesis total utilizan a menudo el ácido lyngbic como intermediario estratégico. Utilizando E. coli que contiene P411-CHF, se produjo el intermedio 5a a escala de 2,4 mmol en un rendimiento aislado del 86%, 2810 TTN, y 94,7:5,3 e.r. La posterior hidrogenación e hidrólisis produjeron cuantitativamente (R)-(+)-6, que puede procesarse posteriormente en ácido (R)-(+)-língbico mediante alquenilación decarboxilativa.
Como parte de las investigaciones sobre el ámbito de los sustratos, la P411-CHF se aplicó a compuestos de alquilaminas. Tales compuestos suelen plantear dificultades para los métodos de funcionalización C-H porque la funcionalidad amina puede coordinarse con el catalizador e inhibirlo o dar lugar a reacciones secundarias indeseables (p. ej., formación de ylidos y reordenamientos asociados). Con los sustratos 7a o 7b, que contienen enlaces C-H bencílicos y enlaces C-H α-amino, el P411-CHF produjo el correspondiente producto α-aminoéster con gran eficacia. En particular, no se observó la inserción de C-H benzílicos (con 7a) o se redujo significativamente (con 7b), a pesar de las energías de disociación de enlaces (BDE) generalmente más bajas de los enlaces C-H benzílicos en comparación con los enlaces C-H α-amino. Además, las N-arilpirrolidinas (7c-7e) resultaron ser sustratos excelentes, sufriendo una alquilación selectiva en la posición α-amino sp3. Con P411-CHF, la alquilación sp3 C-H de 7c superó una reacción de tipo Friedel-Crafts en el anillo arilo, un proceso a menudo favorecido por otros sistemas de transferencia de carbenos. Además, el producto de alquilación 8d ofrece una ruta plausible para la síntesis de β-homoprolina, un motivo estructural relevante para aplicaciones de química medicinal.
Dado que la P411-CHF alquila enlaces C-H α-amino tanto primarios como secundarios, se examinó la selectividad de la enzima para estas posiciones. Empleando N-metil tetrahidroquinolina 7f como sustrato alcano, la P411-CHF proporcionó productos α-aminoéster con 1050 TTN y una proporción 9:1 de regioisómeros (C2:C1), con 73,0:27,0 r.e. para 8f. Dado que el anillo de tetrahidroquinolina es un motivo estructural privilegiado en productos naturales y moléculas bioactivas, su funcionalización selectiva podría ofrecer una estrategia concisa para la síntesis de alcaloides. Para mejorar la selectividad para la alquilación de 7f, se evaluaron variantes a lo largo de la ruta evolutiva desde P-4 A82L hasta P411-CHF. P411-gen5 mostró una regioselectividad aún mayor y proporcionó el producto con la estereopreferencia inversa. En una reacción a escala de 3,0 mmol, E. coli que contenía P411-gen5 produjo 8f en un 85% de rendimiento con una selectividad excelente (1310 TTN, >50:1 r.r., 8,9:91,1 r.e.). En unos pocos pasos, el producto enzimático se convirtió con éxito en el alcaloide (R)-(+)-cuspareína.
Por último, se investigó la incorporación de diferentes grupos alquilo. Utilizando varios reactivos diazo, la alquilación enzimática C-H puede diversificar un sustrato alcano, como 7a, en múltiples productos. El alcance de los sustratos diazo se extiende más allá de los reactivos basados en ésteres; se observó que el compuesto diazo amida de Weinreb 9c y la diazoketona 9d participaban en la alquilación C-H enzimática, dando lugar a los productos 10c y 10d, respectivamente. Sin embargo, la sustitución adicional en la posición α del carbeno no suele ser bien tolerada por la P411-CHF y las enzimas relacionadas actuales. A excepción de 10b, las reacciones con reactivos de carbeno disustituidos no proporcionaron cantidades significativas de los productos deseados.
Este estudio valida que un citocromo P450 puede alcanzar la capacidad de construir enlaces C-C a partir de enlaces sp3 C-H, y que tanto la actividad como la selectividad pueden mejorarse significativamente mediante evolución dirigida. La naturaleza presenta una amplia gama de posibles puntos de partida alternativos para ampliar el alcance de la reacción y conseguir otras selectividades. La superfamilia del citocromo P450 puede procesar una inmensa variedad de moléculas orgánicas para su química de oxigenación nativa; se prevé que las enzimas derivadas de P411 y la diversidad más amplia de proteínas hemo naturales puedan aprovecharse para generar familias de enzimas de alquilación C-H que reproduzcan el alcance y la selectividad característicos de los catalizadores de oxigenación C-H de la naturaleza. |
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